毕赤酵母基因组改造

1. 毕赤酵母菌株介绍及应用

毕赤酵母（Pichia pastoris，现分类为Komagataella phaffii）是一种重要的甲基营养型酵母，在生物技术领域应用广泛。它是目前最常用的真核表达宿主之一，甚至超越了酿酒酵母，广泛应用于基础研究和应用研究中的蛋白质生产。

1.1 显著优势：

（1）高效的蛋白表达能力：能够高效表达多种异源蛋白，包括复杂的真核蛋白，且具有一定的翻译后修饰能力，如糖基化等，使表达的蛋白更接近天然状态。

（2）生长特性优良：可在简单的培养基中快速生长，培养成本低，适合大规模发酵生产。

（3）遗传操作相对简便：虽然其同源重组效率低于酿酒酵母，但通过优化技术手段，如本文介绍的CRISPR/Cas9系统，可实现高效的基因编辑。

1.2 应用领域：

（1）重组蛋白生产：如生产药用蛋白、酶制剂、抗体等。

（2）代谢工程：用于改造代谢途径，生产生物燃料、化学品等。

（3）合成生物学研究：作为模式生物，用于构建人工生物系统和研究基因功能。

2. 毕赤酵母基因编辑流程

2.1 载体构建

（1）Cas9 表达载体构建：选择合适的 Cas9 序列，将其置于强组成型启动子的控制下，并融合核定位序列以确保 Cas9 进入细胞核。

（2）gRNA 表达载体构建：设计针对目标基因的 gRNA 序列，通常选择多个 gRNA 以提高编辑效率。

2.2 转化与筛选

（1）细胞转化：采用电穿孔法将构建好的 CRISPR/Cas9 质粒转化到毕赤酵母感受态细胞中。

（2）筛选阳性克隆：在含有抗生素的培养基上培养转化子，筛选出成功导入质粒的克隆。

2.3 基因编辑与鉴定

（1）基因编辑发生：Cas9-gRNA 复合物在细胞核内识别目标基因序列并切割 DNA，细胞通过非同源末端连接（NHEJ）或同源重组（HR）进行修复，实现基因敲除、敲入或替换等编辑。

（2）基因型鉴定：提取转化子的基因组 DNA，通过 PCR 扩增目标区域并测序，验证基因编辑的结果，如是否存在插入、缺失或替换突变。

（3）表型分析：根据目标基因的功能，进行相应的表型检测。例如，敲除 GUT1 基因可导致菌株在甘油作为碳源的培养基上生长缺陷，可通过在甘油平板上的生长情况筛选突变株。

毕赤酵母基因组改造策略[1]

3. 毕赤酵母基因编辑服务类型

3.1 基因敲除服务

（1）单基因敲除：针对单个目标基因设计 gRNA，利用 CRISPR/Cas9 系统实现基因的高效敲除，适用于研究基因功能、构建基因缺失菌株等。

（2）多基因敲除（ multiplexing）：同时表达多个 gRNA，实现多个基因的同时敲除，可用于研究基因间的相互作用、代谢途径的重构等。

3.2 基因敲入与替换服务

（1）标记基因插入：在目标位点插入标记基因（如 Zeocin 抗性基因），用于筛选和追踪编辑后的细胞。

（2）同源重组介导的基因替换：提供同源供体 DNA cassette，与 CRISPR/Cas9 系统共转化，通过同源重组实现目标基因的替换或特定序列的插入，可用于基因功能互补研究、蛋白标签添加等。

3.2 定制化基因编辑服务

根据客户需求设计特定的基因编辑方案：包括启动子改造、代谢途径优化、蛋白表达优化等，满足客户在基础研究或工业生产中的特殊需求。

4. 毕赤酵母基因编辑技术优势

4.1 高效性

（1）通过优化 Cas9 和 gRNA 的表达系统，基因编辑效率可接近 100%。

（2）对于传统方法难以编辑的基因（如 OCH1），CRISPR/Cas9 系统的编辑效率比传统敲除盒方法高约 50 倍。

4.2 精准性

（1）CRISPR/Cas9 系统通过 gRNA 精确引导 Cas9 到目标位点，实现定点编辑。

（2）可通过设计不同的 gRNA 和供体 DNA，实现多种类型的精准基因操作，如单碱基突变、片段插入或删除等。

4.3 灵活性

（1）只需改变 gRNA 的 20 bp 序列即可重新靶向不同的基因位点，相比 TALEN 等其他基因编辑技术，操作更简便灵活。

（2）支持多基因同时编辑（multiplexing），可在同一菌株中同时改造多个基因，加速代谢途径工程和菌株优化进程。

4.4 标记 - free 编辑

利用自主复制序列构建的质粒可通过非选择性培养实现质粒 curing，从而获得无筛选标记的基因编辑菌株，避免标记基因对后续研究或生产的影响。

4.5 广泛的适用性

可用于编辑毕赤酵母中的多种基因，包括参与甲醇代谢的关键基因（如 AOX1、MXR1、TRM1、MPP1）和影响蛋白糖基化的基因（如 OCH1）等。

5. 项目周期

毕赤酵母标准菌株：2-3个月

毕赤酵母野生菌株：定制化项目，需具体评估

6. 交付标准

（1）靶位点PCR及DNA测序鉴定数据

（2）工程菌株甘油管2支

（3）mRNA转录水平数据（过表达）

（4）项目结题报告

7. 参考文献

[1] Weninger A, Hatzl AM, Schmid C, Vogl T, Glieder A. Combinatorial optimization of CRISPR/Cas9 expression enables precision genome engineering in the methylotrophic yeast Pichia pastoris. J Biotechnol, 2016, 235:139-149.