单细胞TCR免疫组库测序

单细胞TCR免疫组库测序

1. 背景介绍

T细胞受体（T Cell Receptor，TCR）多样性是适应性免疫应答的分子基础，其克隆组成与功能状态与肿瘤免疫、自身免疫性疾病及感染性疾病的发生发展和治疗结局密切相关。传统的Bulk TCR测序通过对混合细胞群体进行测序，能够描述整体克隆谱系，但无法确定同一T细胞的α链与β链天然配对关系，亦无法将克隆型与细胞表型直接关联，限制了对T细胞功能异质性的深入解析。

单细胞TCR测序（single-cell TCR sequencing）基于液滴或微孔单细胞平台，在单细胞分辨率下为每个T细胞加载唯一的细胞条形码（cell barcode）与UMI，实现TCR α链（V-J重组）与β链（V-D-J重组）全长V(D)J序列的天然配对捕获。结合同一平台的单细胞转录组测序（scRNA-seq），可将克隆型信息与细胞表型、功能状态及分化轨迹直接关联，为T细胞免疫研究提供前所未有的分辨率。

在前沿药物研发领域，单细胞TCR测序的价值已得到广泛认可。FDA《Considerations for theDevelopment of CAR T Cell Products》（2024）及中国CDE《免疫细胞治疗产品药学研究与评价技术指导原则（试行）》（2022年第30号）对TCR-T / CAR-T等产品的克隆构成与受体链配对表征提出明确要求；FDA《Long-Term Follow-Up AfterAdministration of Human Gene Therapy Products》（2020）亦关注克隆性扩增等迟发风险的精细化监测。单细胞配对技术可为上述研究与产品表征提供更高精度的数据支持。

舒桐科技提供从样本质检、单细胞捕获建库、高通量测序到系统生物信息分析的全流程服务，助力客户在单细胞分辨率下精准解析T细胞克隆动态与功能异质性。

2. 技术原理

单细胞TCR测序基于5′ V(D)J捕获方案，通过液滴微流控或微孔单细胞平台，在单细胞水平实现TCR全长V(D)J序列的高效扩增与天然配对测序。技术流程分为以下核心步骤：

（1）单细胞悬液制备与捕获

制备高活性单分散细胞悬液后，通过液滴或微孔平台捕获单个T细胞。为每个细胞加载唯一的细胞条形码与UMI，确保后续数据去重与单细胞精准溯源。

（2）逆转录与V(D)J富集建库

采用5′端模板转换策略进行逆转录，靶向富集TCR V(D)J序列——覆盖α链（V-J区）与β链（V-D-J区）全长可变区及γ/δ链（可选）。可同步构建scRNA-seq文库，实现克隆与转录组的同步捕获。经文库制备与样本索引后完成建库。

（3）高通量测序与数据分析

采用Illumina平台完成文库测序。经质控过滤、UMI去重及VDJ序列比对（参考IMGT数据库），完成TCR α/β链序列重建与克隆型（clonotype）注释，输出每个细胞的天然配对TCR信息，进而开展系统性免疫组库多维分析（详见第五节）。

图1 单细胞TCR测序技术流程图

3. 技术特色与优势

（1）天然 α–β 配对

在单细胞分辨率下精确获取每个T细胞α链与β链的天然配对序列，克服Bulk TCR-seq无法确定α-β链天然配对的根本局限，为TCR特异性验证、功能研究及工程化改造提供精准分子基础。

（2）全长V(D)J序列覆盖

完整覆盖TCR可变区（α链V-J区、β链V-D-J区），包含CDR1–CDR3全区域信息，优于仅覆盖CDR3的短片段方案，利于序列还原、数据库比对及后续功能验证。

（3）克隆型与表型精准联动

可与同一平台的scRNA-seq文库联合分析，将TCR克隆型信息与细胞表型（如CD4⁺/CD8⁺亚群、耗竭、激活、记忆分化状态）直接对应，实现“克隆型—表型—功能”多维整合解析。

（4）高分辨率克隆动态追踪

通过UMI校正与细胞级分辨率，支持不同时间点、不同组织来源样本间克隆扩增动态的精准定量比较，适用于治疗前后克隆变化的纵向分析。

（5）标准化分析流程，结果可重复

建立覆盖上游数据处理（Cell Ranger VDJ）至下游免疫组库分析（scRepertoire等主流工具）的标准化流程，多样性指标计算方法及可视化输出规范统一，确保跨样本、跨批次结果可比。

适用范围说明：本服务需要高活性单细胞悬液（活率≥80%，新鲜或合规冻存），不适用于FFPE样本、已裂解RNA、基因组DNA（gDNA）或固定细胞。通量为数千至上万细胞级别，稀有克隆检出率取决于上样细胞数。如需大批量、低成本的整体克隆谱普查，可考虑Bulk TCR-seq方案。

4. 应用场景

细胞治疗产品表征与研究： 针对CAR-T / TCR-T等细胞治疗产品，在单细胞分辨率下确认导入TCR的链配对完整性，解析产品中伴随T细胞的克隆构成与表型分布，支持符合监管要求的产品表征数据建设。

抗原特异性T细胞鉴定： 对经多聚体（tetramer）或其他策略富集的抗原特异性T细胞进行单细胞测序，获取完整配对的TCR序列，为功能验证与TCR-T治疗候选克隆筛选提供依据。

肿瘤浸润T细胞（TIL）分析： 结合转录组数据，解析TIL中克隆扩增程度与功能状态（激活、耗竭、记忆）的对应关系，辅助肿瘤免疫微环境研究及免疫检查点治疗机制探索。

克隆性监测与长期随访： 在细胞治疗或基因治疗产品的长期随访场景中，追踪特定克隆的动态变化，为克隆性扩增风险评估提供精细化数据。

自身免疫与感染免疫研究： 解析疾病相关T细胞克隆的扩增规律与特异性TCR基序，支持致病克隆鉴定与疫苗应答评估。

5. 报告与交付内容

报告涵盖从测序质控到系统性免疫组库分析的完整内容，核心分析模块包括：

· 测序质控与细胞过滤统计（UMI分布、有效细胞数、α/β链配对率）

· 配对克隆型（α–β）鉴定、计数与频率统计

· 克隆多样性指标（Shannon熵、Gini系数、克隆扩增指数等）

· V/D/J基因使用频率分析（频率分布与基因组合规律）

· CDR3序列特征分析（长度分布、氨基酸组成及序列基序）

· 克隆扩增图谱与高扩增克隆TOP列表及序列信息

· 样本间共享克隆分析与时序克隆追踪（多样本时适用）

· （可选）克隆型与表型联合分析：整合scRNA-seq数据，在细胞亚群UMAP投影中叠加克隆型信息

交付物：图文分析报告（PDF）+ 克隆型详细信息表（Excel/CSV，含每个细胞的配对TCR序列、V/D/J基因注释及克隆频率）+ 原始测序数据（FASTQ）

图2 主要分析输出示例概览

6. 服务流程

*服务周期：标准流程25-30个工作日

7. 样本要求

*注：具体活率要求、目标细胞数及运输要求以最新《送样信息单》为准；活细胞样本时效性强，请提前预约并确认方案。如需同时开展流式分选、抗原特异性富集或细胞激活等前处理，可根据项目需求灵活组合。

8. 参考文献

[1] U.S. Food and Drug Administration. Considerations for the Development of CAR T Cell Products; Draft Guidance. 2024.

[2] 国家药品监督管理局药品审评中心. 免疫细胞治疗产品药学研究与评价技术指导原则（试行）. 2022年第30号通告.

[3] U.S. Food and Drug Administration. Long-Term Follow-Up After Administration of Human Gene Therapy Products; Guidance for Industry. 2020.

[4] Borcherding N, Bormann NL, Kraus G. scRepertoire: An R-based toolkit for single-cell immune receptor analysis. F1000Res. 2020;9:47.

[5] Wu TD, Madireddi S, de Almeida PE, et al. Peripheral T cell expansion predicts tumour infiltration and clinical response. Nature. 2020;579(7798):274–278.