TCR-多重PCR测序
TCR-多重PCR测序
1. 背景介绍
T细胞受体（TCR）多样性是适应性免疫应答的分子基础，其克隆组成与功能状态与肿瘤免疫、自身免疫性疾病及感染性疾病的发生发展和治疗结局密切相关。传统的Bulk TCR测序手段中，多重PCR法以成熟的引物设计体系直接扩增重排的CDR3区，兼容基因组DNA（gDNA）与FFPE等多种样本形式，在克隆频率的稳健定量上具有显著优势，是血液肿瘤克隆性判定与微小残留病灶（MRD）监测研究中监管接受度最高的技术路线。
在前沿药物研发与转化医学领域，TCR多重PCR测序的应用价值已获广泛认可。FDA《Hematologic Malignancies: Regulatory Considerations for Use of Minimal Residual Disease》（2020）将基于NGS的TCR/Ig重排检测列为MRD评估方法之一；EuroClonality-NGS联盟在经典BIOMED-2引物体系基础上制定的NGS标准化方案，进一步确立了该路线在克隆性判定中的国际权威地位。针对TCR-T/CAR-T等细胞治疗产品，FDA《Considerations for the Development of CAR T Cell Products》（2024）及中国CDE《免疫细胞治疗产品临床试验技术指导原则（试行）》（2021）亦对T细胞克隆性扩增与产品表征提出明确要求。
舒桐科技提供从样本质检、多重PCR建库、高通量测序到系统生物信息分析的全流程服务，助力客户以稳健、经济的方式精准解析T细胞克隆动态，为免疫监测、MRD研究及细胞治疗产品科研表征提供高质量数据支撑。
2. 技术原理
图1 多重PCR扩增TCR重排区技术流程图
技术流程分为以下核心步骤：
（1）核酸提取
从待测样本提取基因组DNA（gDNA）或总RNA，并进行质量检测与定量。DNA法对样本兼容性更广，可支持FFPE及部分降解样本；RNA法需保证RIN值合格，可引入UMI进一步校正扩增偏好。
（2）多重PCR扩增建库
采用覆盖TCR各V、J基因的多重引物组，直接扩增重排的CDR3区（含部分V区）。第一轮PCR完成靶向扩增后，第二轮PCR加入测序接头与样本唯一索引（UDI），完成文库构建；经文库质控与定量后等量混样。
（3）高通量测序与数据分析
采用Illumina平台完成测序，读取CDR3序列。经质控过滤、序列比对（参考IMGT数据库）完成克隆型鉴定与定量，进而开展系统性免疫组库多维分析。
3. 技术特色与优势
· 样本兼容广：支持gDNA、FFPE及珍稀样本（DNA法），对样本质量要求相对宽松。
· 定量稳健：DNA法下一个T细胞携带一份重排模板，可按细胞当量准确估算克隆频率。
· 灵敏度高：适合低频克隆检测，可用于MRD相关研究。
· 流程成熟：与FDA批准的MRD检测方法（clonoSEQ）同路线，监管接受度高。
· 可选UMI（RNA法）：进一步校正扩增偏好，提升定量精度。
· 成本与周期友好：流程标准化，可规模化操作。
适用边界说明：本路线以CDR3为主，非全长V(D)J序列，且为Bulk测序（不提供单细胞级α–β链配对）。引物效率差异可带来一定扩增偏好。如需全长序列、无偏扩增或α–β天然配对，建议选用TCR 5'RACE全长测序或单细胞TCR免疫组库测序。
4. 应用场景
· 血液肿瘤克隆性与MRD研究：克隆性判定、优势克隆追踪（科研用途）。
· 免疫监测与克隆追踪：治疗前后、不同时间点的T细胞克隆动态分析。
· FFPE回顾性研究：利用存档组织样本开展队列分析。
· 细胞治疗研究：T细胞克隆动态的稳健定量，支持CAR-T等产品科研表征。
5. 报告与交付内容
报告涵盖从测序质控到系统性免疫组库分析的完整内容，核心分析模块包括：
分析模块 | 内容 |
数据质控 | reads质量统计与过滤 |
克隆型（CDR3） | 克隆型鉴定与定量 |
多样性与克隆性 | 多样性指数；克隆性/不均一度 |
基因使用频率 | V/J基因使用频率分布 |
CDR3特征分析 | CDR3长度分布与氨基酸组成 |
优势克隆与追踪 | Top克隆列表、样本间共享克隆与动态追踪 |
细胞当量（DNA法） | 按模板数估算克隆的细胞当量/频率 |
交付物：图文分析报告（PDF）+ 克隆型详细数据表（Excel/CSV）+ 原始测序数据（FASTQ）
图2 TCR免疫组库多维分析结果示意图
6. 服务流程
服务环节 | 服务内容 |
项目咨询与方案设计 | 根据研究目的、样本类型及分析需求，制定个性化建库测序与生信分析方案 |
样本接收与质检 | 对送检样本进行核酸质量检测、浓度定量及质控评估 |
多重PCR建库 | 核酸提取/QC → 多重PCR扩增 → 接头连接与索引添加 → 文库质控 |
高通量测序 | 采用Illumina平台完成测序，按样本数与文库类型配置测序量 |
生物信息分析 | 克隆型鉴定、多样性分析、基因使用频率及可视化 |
报告交付与技术支持 | 提供完整分析报告（PDF）及克隆型数据文件，并提供后续技术咨询 |
7. 样本要求
服务项目 | 送样要求 |
基因组DNA（gDNA） | 推荐；定量稳健，兼容FFPE及多种来源样本 |
总RNA（可选） | 需RIN值合格；RNA法 + 恒定区引物可更易区分亚型，采血勿用肝素抗凝 |
FFPE组织 | 多重PCR兼容；核酸质量影响灵敏度与定量 |
细胞/新鲜组织 | 可代为提取核酸；活率与细胞数以《送样信息单》为准 |
*注：具体起始量及运输要求以最新《送样信息单》为准；送样前建议先沟通确认方案。
8. 技术参数
参数项 | 说明 |
测序平台 | Illumina |
起始模板 | gDNA或RNA（含FFPE，DNA法） |
覆盖范围 | CDR3（含部分V区），非全长 |
检测链 | TRB（默认）；TRA/TRG/TRD可按需 |
UMI | RNA法可选 |
定量特性 | DNA法可估算细胞当量/克隆频率 |
支持物种 | 人；小鼠等另询 |
9. 参考文献
[1] U.S. Food and Drug Administration. Hematologic Malignancies: Regulatory Considerations for Use of Minimal Residual Disease in Development of Drug and Biological Products. 2020.
[2] U.S. Food and Drug Administration. Considerations for the Development of CAR T Cell Products; Draft Guidance. 2024.
[3] van Dongen JJ, et al. EuroClonality-NGS Working Group. Standardized next-generation sequencing of immunoglobulin and T-cell receptor gene recombinations. Leukemia. 2012.
[4] 国家药品监督管理局药品审评中心. 免疫细胞治疗产品临床试验技术指导原则（试行）. 2021年第15号通告.
