TCR-5'RACE全长测序

TCR-5'RACE全长测序

1. 背景介绍

T细胞受体（T Cell Receptor，TCR）通过V(D)J基因片段的随机重组与连接区核苷酸增删产生庞大的克隆型多样性，是适应性免疫识别肿瘤抗原、病原体及自身抗原的分子基础。完整的TCRα/β链V(D)J序列承载了克隆识别特异性的全部信息——包括决定抗原识别的CDR3、辅助接触的CDR1/CDR2以及框架区（FR1–FR4），是免疫组库精细解析、抗原特异性克隆挖掘与TCR工程化改造不可或缺的数据基础。

基于RNA的5'RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）策略借助SMART模板转换在cDNA 5'端引入通用接头，仅用一对引物即可扩增覆盖所有V基因家族的全长可变区，从根本上规避多重PCR体系中数十至上百条V/J引物效率差异导致的扩增偏好；联合分子条形码（UMI）实现PCR重复去除与测序错误纠正，使克隆丰度定量更接近真实分子计数。

在监管与行业层面，FDA《Hematologic Malignancies: Regulatory Considerations for Use of Minimal Residual Disease in Development of Drug and Biological Products for Treatment》（2020）将基于NGS的Ig/TCR重排检测列为MRD评估方法之一；FDA《Considerations for the Development of CAR T Cell Products》（2024）与《Long-Term Follow-Up After Administration of Human Gene Therapy Products》（2020）对TCR-T/CAR-T的克隆构成、迟发风险及长期随访提出明确要求；中国CDE《免疫细胞治疗产品药学研究与评价技术指导原则（试行）》（2022年第30号）同样强调TCR库表征。EuroClonality-NGS联盟在BIOMED-2引物体系基础上建立了TR重排NGS标准化方案。基于RNA的全长V(D)J + UMI路线可为上述方向提供高分辨率、可复现的克隆型数据。

珠海舒桐医疗科技有限公司提供从样本质控、cDNA合成与文库构建、高通量测序到系统免疫组库生物信息分析的全流程服务，助力客户在全长分辨率下精准刻画TCR克隆动态与功能演化轨迹。

2. 技术原理

本服务基于SMART模板转换与5'RACE策略，以总RNA为起始模板，通过半巢式PCR富集TCR全长V(D)J序列，并在文库构建早期引入12-nt UMI以实现单分子定量。核心步骤如下：

（1）RNA起始与逆转录

以高质量总RNA（RIN≥7）为模板，oligo-dT引导逆转录合成第一链cDNA，覆盖含poly(A)尾的TCR转录本。

（2）SMART模板转换与UMI引入

逆转录酶在cDNA 5'端发生模板转换，引入含12-nt UMI的通用接头序列，每条原始mRNA分子获得唯一分子标识，为后续去重纠错奠定基础。

（3）半巢式PCR富集与索引

PCR1以通用5'接头与TCR恒定区特异性引物进行选择性扩增；PCR2在两端加入UDI双端样本索引及Illumina测序接头，形成约600–900 bp的全长文库。

（4）高通量测序与数据分析

采用Illumina平台2×300 bp双端测序覆盖全长V(D)J；经UMI去重、错误校正与IMGT/MiXCR比对，完成TCRα/β克隆型重建、克隆频率定量与系统免疫组库多维分析（详见第五节）。

图1 TCR 5'RACE全长测序技术流程图

3. 技术特色与优势

（1）无偏全长扩增

单对引物覆盖全部TRAV/TRBV基因家族，从根本上规避多重PCR的引物偏好性，使克隆丰度更接近真实分子比例；完整覆盖FR1–FR4 + CDR1–CDR3全部可变区，优于仅覆盖CDR3的短片段方案。

（2）UMI精准定量与纠错

12-nt UMI提供约1700万种分子标签组合，对PCR复制偏差与测序错误进行系统校正，避免错误读数被误判为新克隆而人为放大多样性，实现按原始分子计数的精准定量。

（3）α/β双链可选检测

支持TCRα、TCRβ单独或同步检测，灵活适配不同研究目标；如需单细胞分辨率下的α–β天然配对，可选择单细胞TCR测序方案。

（4）低起始量友好

最低支持10 ng PBL总RNA起始，适用于外周血、组织、分选T细胞等多种样本类型，珍稀样本亦具备可行性。

（5）标准化分析流程

建立从原始数据质控、UMI去重、克隆型重建（MiXCR/IMGT）到多样性指数计算、克隆动态追踪及可视化输出的标准化流程，确保跨样本、跨批次结果可比，原始FASTQ全程交付，支持二次深度挖掘。

适用范围说明：本服务以RNA为起始模板，要求RIN≥7的高质量总RNA；不适用于FFPE样本、纯gDNA或已严重降解的RNA。如样本类型为gDNA或FFPE，建议选择TCR多重PCR测序方案。

4. 应用场景

肿瘤免疫与细胞治疗：CAR-T/TCR-T等过继性细胞治疗产品回输前后T细胞克隆动态监测、扩增持久性评估及伴随T细胞克隆构成分析，支持产品表征与长期随访研究。

抗原特异性T细胞研究：与多聚体（tetramer）富集、TCR刺激扩增等策略联合，全长解析抗原特异性T细胞克隆的TCRα/β序列，为TCR-T候选克隆筛选提供完整可变区信息。

自身免疫与感染免疫：识别并追踪致病性或保护性T细胞克隆，解析疾病相关TCR基序与公共克隆，支持疫苗免疫原性评估与免疫应答动态刻画。

移植免疫与免疫重建：解析造血干细胞移植或器官移植前后T细胞组库变化，监测排斥反应相关克隆扩增与免疫重建轨迹。

克隆动态纵向追踪：针对治疗前后、不同时间点或不同组织来源样本，精准定量比较克隆扩增/收缩动态及样本间共享克隆。

5. 报告与交付内容

报告涵盖从测序质控到系统性免疫组库分析的完整内容，核心分析模块包括：

·测序数据质控与UMI去重统计（reads质量、比对率、UMI分布、有效分子数）

·克隆型鉴定与定量（UMI校正后的TCRα/β克隆型表、频率分布）

·克隆多样性与克隆性指标（Shannon熵、Simpson指数、Chao1、Gini系数等）

·V/D/J基因使用频率分析（TRAV/TRAJ、TRBV/TRBD/TRBJ频率与基因组合规律）

·CDR3序列特征分析（长度分布、氨基酸组成与序列基序）

·Top优势克隆排名与完整克隆型序列信息

·样本间共享克隆分析与时序克隆动态追踪（多样本时适用）

·（可选）公共克隆与IMGT等数据库比对、定制化可视化分析

交付物：图文分析报告（PDF）+ 克隆型详细信息表（Excel/CSV，含V/D/J基因注释、CDR3核酸/氨基酸序列、UMI计数及克隆频率）+ 原始测序数据（FASTQ）。

图2 TCR免疫组库多维分析结果示意图

6. 服务流程

7. 样本要求

*注：RNA需溶于无核酸酶水、不得含poly(A) carrier；采血请勿使用肝素抗凝；细胞建议以Ca²⁺/Mg²⁺-free PBS洗涤≥2次，不可使用固定细胞；避免反复冻融，建议按2–3倍余量送样；干冰全程冷冻运输。具体送样要求以最新《送样信息单》为准，送样前请预约并确认方案。本服务不适用于FFPE样本、纯gDNA或已严重降解的RNA。

8. 技术参数

9. 参考文献

[1] U.S. Food and Drug Administration. Hematologic Malignancies: Regulatory Considerations for Use of Minimal Residual Disease in Development of Drug and Biological Products for Treatment; Guidance for Industry. 2020.

[2] U.S. Food and Drug Administration. Considerations for the Development of CAR T Cell Products; Draft Guidance. 2024.

[3] U.S. Food and Drug Administration. Long-Term Follow-Up After Administration of Human Gene Therapy Products; Guidance for Industry. 2020.

[4] 国家药品监督管理局药品审评中心. 免疫细胞治疗产品药学研究与评价技术指导原则（试行）. 2022年第30号通告.

[5] Knecht H, et al. Quality control and quantification in IG/TR next-generation sequencing marker identification: protocols and bioinformatic functionalities by EuroClonality-NGS. Leukemia. 2019.