载体转录本剪接与表达分析
载体转录本剪接与表达分析
以高深度链特异 Illumina 短读 RNA-seq，对载体相关转录本的剪接位点（junction）与表达量（TPM）进行单碱基精度判读与独立定量，作为 PacBio Iso-Seq 长读长全长转录本结论的配对正交验证。
1. 背景介绍
与 DNA 层面类似，载体相关转录层面也存在长读长看结构、短读看深度与精度的互补关系。长读长 Iso-Seq 一条 read 给出从 5′ 到 polyA 的完整 isoform 结构与融合连接，擅长看全貌；短读 RNA-seq 在单碱基精度下精确判读剪接位点（junction），灵敏检出低丰度异常转录本，并以高深度提供独立的表达定量（TPM）。两者并用，结构与定量互证，证据更稳健。
表达量（如 TPM）是评估转基因表达水平与一致性的常用指标。用一个原理不同的高深度平台独立给出 TPM，与全长结构结论互相印证，能显著增强转录层面证据的可信度。当结论将进入申报数据包或用于关键决策时，长短读配对验证更具说服力。
isoform 指同一基因经不同剪接或起止位点产生的不同 RNA 版本。在载体相关转录层面，核心问题是：功能性全长转录本占比多少、是否存在异常或融合版本。短读测序擅长定量与位点精度，但难以独立还原从 5′ 到 polyA 的完整转录本结构与融合连接，这正是长读长 Iso-Seq 的用武之地。
图1. 长读 Iso-Seq 与短读 RNA-seq 互补关系示意图
在监管与行业层面，相关指导原则同样适用：ICH Q6B 要求含鉴别在内的质量标准与接受标准；FDA《Considerations for the Development of CAR T Cell Products》（终版，2024）要求对鉴别、效价与安全性作出评估；中国 CDE《免疫细胞治疗产品药学研究与评价技术指导原则（试行）》（2022）对 CAR-T 等产品的药学研究与安全性提出明确要求。本服务作为转录层面结论的正交确认，与载体全长转录本分析配套使用。
2. 技术原理
本服务以链特异 Illumina 短读 RNA-seq 为核心，与载体全长转录本分析使用平行样本，结果逐项对照。链特异文库可区分转录方向，利于判读载体转录与剪接事件；高深度测序稳定检出并定量低丰度事件，对剪接位点提供单碱基精度。核心步骤如下：
（1）样本接收与质检
接收细胞渣或已提取 RNA，评估浓度、纯度与完整性，建议与载体全长转录本分析使用同批样本以便互验。
（2）链特异文库制备
制备链特异 RNA-seq 文库，区分转录方向，提升剪接判读的方向性可靠度。
（3）高深度短读测序
在 Illumina 平台运行至高深度，保证低丰度转录本与剪接位点的灵敏检出与稳定定量。
（4）生物信息分析与一致性互验
生物信息分析与一致性互验。
图2. 链特异 RNA-seq 与 Iso-Seq 一致性互验流程图
3. 技术特色与优势
（1）剪接位点单碱基精度
高深度短读对 junction 位点提供单碱基精度判读，是确认剪接事件位置与外显子边界的强项。
（2）低丰度事件灵敏检出
高深度配合链特异建库，可稳定检出并定量低丰度异常转录本与稀有剪接事件。
（3）独立表达定量
以与长读长不同原理的平台独立给出 TPM，为表达完整性与一致性提供旁证。
（4）与长读长平台正交互验
使用平行样本，与载体全长转录本分析（Iso-Seq）逐项比对 junction、PSI、isoform 一致性，形成结构 + 精度 + 定量的完整证据。
（5）以客户载体为定制参考
以客户提供的载体全序列为定制参考逐条比对，结论可量化、带位点、可比较。
4. 应用场景
关键转录结论的正交验证：对 Iso-Seq 全长结构与融合事件结论进行独立平台确认。
剪接位点精确定位：在已发现可变剪接或异常 junction 时，提供单碱基精度复核。
独立表达定量：为转基因表达水平与一致性提供 TPM 级别证据。
申报数据包加固：在 IND/BLA 节点用配对验证显著提升数据可信度。
5. 报告与交付内容
报告以正交互验为核心，核心内容包括：
·剪接位点（junction）清单与外显子使用率（PSI）。
·载体相关转录本的独立表达定量（TPM）。
·与 Iso-Seq 长读长结果的一致性互验报告，明确哪些 isoform 与 junction 双平台互相印证、哪些需重点关注。
·异常或低丰度转录本的灵敏性补充检出结果。
·数据交付：完整分析报告（PDF）、junction/PSI/TPM 结果文件、原始测序数据。
6. 服务流程
服务环节 | 服务内容 |
项目咨询与方案设计 | 根据载体类型与配对验证需求，制定链特异短读测序方案 |
| 样本接收与质检 | 评估 RNA 浓度、纯度与完整性，建议与 Iso-Seq 同批送样 |
| 文库制备 | 制备链特异 RNA-seq 文库 |
高通量测序 | 在 Illumina 平台运行至目标高深度 |
生物信息分析 | 调用 junction/PSI/TPM，并与 Iso-Seq 结果逐项比对一致性 |
报告交付与技术支持 | 提供完整互验报告（PDF）、结果文件及原始数据，并提供后续技术咨询 |
7. 样本要求
项目 | 送样要求 |
样本类型 | 细胞渣或已提取的 RNA；建议与载体全长转录本分析同批送样以便互验 |
推荐起始量 | 建议总 RNA ≥ 2ug（具体以《送样指南》为准，建议按最低起始量留足余量） |
浓度与质量 | 建议 RNA 浓度 ≥ 20 ng/μL；OD260/280 ≈ 1.8-2.1；RIN ≥ 7 或 DV200 ≥ 70%，无明显降解 |
| 保存与运输 | -80 ℃ 冻存，干冰全程冷链运输 |
*具体送样要求以最新《送样指南》为准；本服务不适用于已严重降解的样本。送样前请预约并确认方案。
8. 技术参数
参数项 | 说明 |
测序平台 | Illumina 高通量平台（短读长 |
文库类型 | 链特异 RNA-seq 文库。 |
读长策略 | 双端测序，按项目需要选择读长 |
适用样本 | 细胞渣或已提取 RNA |
比对参考 | 以客户提供的载体全序列与人参考基因组为定制参考 |
| 检出能力 | 剪接位点（junction）、外显子使用率（PSI）、表达定量（TPM）、低丰度异常转录本 |
测序深度 | 按目标灵敏度设定，低丰度事件检出与定量精度依测序深度而定 |
互验方式 | 与载体全长转录本分析（PacBio Iso-Seq）使用平行样本逐项比对 |
| 方法状态 | IND：方法确认（fit-for-purpose）；BLA：依ICH Q2（R2）完整验证 |
支持物种 | 以人源细胞为主，其他物种依客户载体序列定制 |
9. 参考文献
[1] ICH. Q6B: Specifications: Test Procedures and Acceptance Criteria for Biotechnological/Biological Products. Current Step 4 version, 10 March 1999.
[2] ICH. Q2(R2): Validation of Analytical Procedures. Step 4 version, adopted 1 November 2023.
[3] U.S. Food and Drug Administration (FDA), Center for Biologics Evaluation and Research (CBER). Considerations for the Development of Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cell Products. Final, January 2024. (Docket No. FDA-2021-D-0404)
[4] 国家药品监督管理局药品审评中心（CDE）. 免疫细胞治疗产品药学研究与评价技术指导原则（试行）. 通告 2022 年第 11 号，2022 年发布。
