CRISPR文库应用案例 | 利用 CRISPR/Cas9 建立番茄转录因子突变体库！

背景

番茄是重要的蔬菜作物，是植物基因功能研究的模式作物之一。构建饱和突变库是进行基因组水平的基因功能研究的有效途径，传统的EMS或射线突变库构建费时费力，定位突变位点也不方便。CRISPR/Cas9技术可用于高通量基因敲除，如已经在水稻和玉米中成功应用。

转录因子家族在植物生长发育和逆境响应中起重要作用，构建西红柿转录因子CRISPR/Cas9编辑库将有助于快速获得理想基因编辑材料，对番茄基因功能解析具有重要意义。

2023 年 10 月22 日，Plant Physiology and Biochemistry杂志在线发表了沈阳农业大学齐明芳团队的最新研究成果：‘Construction of transcription factor mutagenesis population in tomato using a pooled CRISPR/Cas9 plasmid library’，研究人员鉴定了番茄基因组中的 990 个转录因子，设计并合成了包含 4379 个 sgRNA 的 CRISPR/Cas9 质粒文库。利用该文库，获得了487株T0阳性植物，其中92株含有单一sgRNA序列，针对65个不同的转录因子，突变率为23%。在T0突变群体中，观察到纯合突变和双等位基因突变的发生频率较高。

本文的研究也遇到了一些挑战。例如，大规模的CRISPR/Cas9突变库中，有81%的植株同时含有多个sgRNA，这使得后续的基因型鉴定变得困难。但是，研究者们也正在寻找解决方案，例如构建小规模的CRISPR/Cas9突变库，以提高单一sgRNA的识别率。它们利用针对 30 个转录因子的小规模 CRISPR/Cas9 文库可以增强阳性植物中单个 sgRNA 识别的效率，将其从 19% 提高到 42%。从突变体群体中鉴定出的几个突变体的表型特征证明了本文的 CRISPR/Cas9 突变体文库的实用性。

本研究为番茄中 CRISPR/Cas9 介导的大规模敲除文库的实施和优化提供了见解。

实验探索流程：

1. 设计和合成了针对西红柿基因组中990个转录因子的CRISPR/Cas9-sgRNA库。
2. 将该CRISPR/Cas9质粒库转化入农杆菌，制备农杆菌浸润液进行西红柿遗传转化。
3. 对获得的T0代转基因植株进行PCR和测序，鉴定阳性植株中整合的sgRNA序列。
4. 对单一sgRNA植株进行目标位点测序，鉴定各种类型的突变。
5. 对T1代突变体进行大规模播种，进行表型观察和功能筛选。
   

• SlTCP29：该基因敲除可引起叶片边缘的锯齿化，种子发育不良等表型，提示其参与了叶片发育和种子发育过程。
• SlJAF13：该基因敲除可降低花青素含量，增加节间数，促进腋芽生长，提示其既参与花青素合成，也可能调控植株生长发育。
• SlNGALike1：该基因敲除可使子叶边缘锯齿加深，提示其可能参与调控叶片发育。
• SlERF13：该基因敲除未见明显表型，需要进一步探究其功能。

本文利用CRISPR/Cas9技术，针对番茄基因组中的990个转录因子设计并合成了一个sgRNA库，成功地在番茄中获得了转录因子的突变群体。这会推动番茄基因功能的研究，已获得的突变植株，为进一步研究这些转录因子在番茄生长、发育和抗逆性中的功能提供了材料。通过本研究，我们可以看到CRISPR/Cas9技术在农作物基因功能研究和遗传改良中的巨大潜力，对于推动农作物的遗传改良和提高农作物的农艺性状具有重要的意义。

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