食品用微生物鉴定及安全性评价

食品用微生物鉴定及安全性评价

1. 背景介绍

食品用菌种（发酵剂菌种、益生元生产用菌株、食品添加剂及酶制剂生产菌等）在投入使用前，需要依据国家食品安全相关标准完成菌种鉴定与安全性评价，明确其分类学地位，并系统排查毒力因子、抗菌药物耐药基因、毒素相关基因等潜在生物安全风险。

2025年发布实施的食品安全国家标准《食品用菌种安全性评价程序》（GB 31615.2-2025）明确了基于全基因组测序数据开展安全性评价的技术路径，成为目前食品用菌种申报和评价的重要依据。相比早期以16S rRNA等标记基因鉴定为主的方式，全基因组层面的分析能够更全面地覆盖毒力、耐药及移动遗传元件相关信息，评价结论更为扎实可靠。

本方案基于全基因组测序及生物信息学分析技术，为食品加工用发酵剂菌种、益生元生产菌株、食品添加剂/酶制剂生产菌种及其他食品用微生物提供菌种鉴定与安全性评价服务，助力企业完成新食品原料备案、菌种目录申报及日常生产质量控制。

2. 技术原理与分析流程

菌种鉴定与安全性评价并非两个各自独立的检测项目，而是建立在同一套全基因组数据基础上的连续分析过程：毒力基因、耐药基因等安全性风险因子在基因组上的分布位置并不固定，传统标记基因方法（如16S rRNA/18S rRNA/ITS）主要用于分类学鉴定，无法覆盖基因组水平的耐药、毒力及移动遗传元件分析，因此安全性评价需要依赖全基因组测序（WGS）数据。本方案采用"测序—质控—组装—注释—鉴定—安全性评估"的整合分析流程；同时，细菌（原核生物）与真菌（真核生物）在基因组结构上存在显著差异，具体分析策略和数据库有所不同，故分别说明。

2.1 整体分析流程

• DNA提取：获取高质量基因组DNA，纯度和完整性需满足后续测序建库要求。

• 全基因组测序：根据菌株复杂程度选择二代测序（NGS）或二代+三代混合测序（NGS+TGS），后者适用于含质粒、结构复杂或需要完整图谱的菌株。

• 数据质控（QC）：对原始测序数据进行质量评估与过滤，确保下游分析数据准确可靠。

• 基因组组装：根据菌株类型及测序策略选择适宜的组装方案。混合组装根据菌株差异采用不同策略：细菌基因组可采用Unicycler等混合组装流程；真菌及复杂基因组可采用Flye等长读长组装工具，并结合二代测序数据进行纠错优化。

• 基因预测与结构注释：对组装完成的基因组进行编码区预测和功能注释，为后续同源比对提供基础。

• 菌种鉴定：以标记基因（16S rRNA/18S rRNA/ITS）比对作为初步鉴定，并以全基因组平均核苷酸一致性（ANI，通常以约95%-96%作为细菌物种划分的重要参考标准）与模式菌株基因组比对进行最终确证，必要时结合数字DNA-DNA杂交值（dDDH）交叉验证。

• 安全性评估：包括毒力基因、耐药基因、致病相关基因的序列比对筛查，质粒复制子与可移动遗传元件分析，以及针对产毒素能力、溶血性等表型的湿实验验证——序列层面的比对只能提示潜在风险，功能是否真实表达仍需表型实验加以确认。

图1 整体分析流程图

2.2 细菌（原核生物）分析流程要点

细菌基因组结构相对紧凑、无内含子，且常携带质粒，在整体流程基础上有以下侧重：

• 基因预测注释：采用原核生物专用注释工具（如Prokka），流程成熟、速度快。

• 质粒与可移动元件分析：细菌质粒是耐药/毒力基因水平转移的常见载体，需重点通过PlasmidFinder等工具识别质粒复制子类型，分析风险基因在染色体或质粒中的定位情况，辅助判断潜在水平传播风险。

• 菌种鉴定参考体系：细菌鉴定通常结合16S rRNA初步分类、全基因组ANI分析及参考基因组比较，ANI物种划分标准在原核生物中应用较为成熟。

图2 细菌全基因组测序组装与安全性分析流程

图3 细菌基因组Circos图（示例）

2.3 真菌（真核生物）分析流程要点

• 真菌作为真核生物，基因组通常远大于细菌、含内含子、染色体多为线性结构，在整体流程基础上有以下侧重：

• 基因预测注释：需采用适配真核生物基因结构（含内含子剪接）的预测工具，注释复杂度和计算量高于原核生物。

• 菌种鉴定参考体系：真菌鉴定除基于全基因组序列相似性分析外，通常结合18S rRNA、ITS等经典分子标记，并利用UNITE等真菌专用数据库进行分类注释，不能直接采用细菌ANI物种划分阈值，需结合多维度证据综合判断。

• 次级代谢产物筛查：真菌基因组中常含有PKS、NRPS等次级代谢产物合成基因簇，部分可能与真菌毒素或其他有害代谢产物相关，建议采用antiSMASH等工具进行专项预测，作为安全性评估的补充内容。

图4 真菌全基因组测序组装与安全性分析流程

图5 真菌基因组Circos图（示例）

3. 技术优势

4. 适用范围与依据标准

5. 应用场景

• 新食品原料及食品用菌种目录申报：为拟申报的食品用菌种提供符合GB 31615.2-2025要求的全基因组鉴定与安全性评价数据，支持新食品原料及菌种目录申报材料准备。

• 发酵食品生产用菌种质量控制：作为发酵食品（酸奶、泡菜、酱腌菜、发酵豆制品等）生产用菌种建档及批次放行检测的关键环节，确保原料菌种符合安全性要求。

• 食品添加剂/酶制剂生产菌种安全性备案：为食品添加剂、酶制剂生产用微生物提供分类学鉴定及安全性评价支持，满足相关备案要求。

• 益生元及功能性食品配方菌种验证：为功能性食品配方中使用的菌种提供安全性验证数据，支持产品配方合规性说明。

• 委托加工与供应链菌种核验：帮助食品企业核验委托加工或采购的菌种是否与申报/宣称的菌种一致，排查潜在的菌种替换或污染风险。

6. 服务内容与样本要求

6.1 服务内容

6.2 样本与信息要求

7. 参考资料

[1] 中华人民共和国食品安全法（2021年修正）。

[2] GB 31615.2-2025 食品安全国家标准 食品用菌种安全性评价程序。

[3] GB 4789.35、GB 4789.34、GB 4789.28、GB 4789.45 等食品安全国家标准，食品微生物学检验相关系列标准（均以现行有效版本为准）。

[4] 保健食品原料用菌种安全性检验与评价技术指导原则（2020年版），国家市场监督管理总局。

[5] Richter, M., & Rosselló-Móra, R. (2009). Shifting the genomic gold standard for the prokaryotic species definition. PNAS, 106(45), 19126-19131.

[6] Jain, C., et al. (2018). High throughput ANI analysis of 90K prokaryotic genomes reveals clear species boundaries. Nature Communications, 9, 5114.

[7] Seemann, T. (2014). Prokka: rapid prokaryotic genome annotation. Bioinformatics, 30(14), 2068-2069.

[8] Alcock, B. P., et al. (2020). CARD 2020: antibiotic resistome surveillance with the comprehensive antibiotic resistance database. Nucleic Acids Research, 48(D1), D517-D525.

[9] Chen, L., et al. VFDB: a reference database for bacterial virulence factors. Nucleic Acids Research.

[10] Nilsson, R. H., et al. The UNITE database for molecular identification of fungi. Nucleic Acids Research.

[11] Blin, K., et al. antiSMASH: automatic identification, annotation and analysis of secondary metabolite biosynthesis gene clusters. Nucleic Acids Research.