环境样本噬菌体分离

1. 研究背景

细菌耐药（AMR）已成为全球公共卫生的重大威胁，多重耐药菌导致的感染在临床、养殖与食品加工环节持续蔓延，传统抗生素研发速度难以跟上耐药演化的步伐。噬菌体作为特异性侵染细菌的病毒，是地球上数量最庞大的生物实体（估计总量可达 10³¹ 个颗粒），广泛存在于污水、土壤、水体、粪便及各类环境基质中，构成了几乎取之不尽的天然抗菌资源库。

然而，噬菌体的宿主谱通常极为狭窄，往往精确到菌株水平。这意味着针对某一株特定的临床耐药菌、食源性致病菌、水产/畜禽病原菌或植物病原菌，几乎不可能从现有商业化产品中"买到"合适的噬菌体，只能以目标菌株为指示菌，从环境样本中定向分离获得。分离环节的成败与效率，直接决定了后续噬菌体治疗、生物防控、检测试剂开发等所有下游工作的起点。

在此背景下，舒桐生物推出以客户指定宿主菌为靶标的定制化环境噬菌体分离服务。我们依托多来源环境样本采集网络、标准化富集筛选体系以及完善的表征与质控平台，为客户提供从样本采集、富集分离、单斑纯化，到生物学表征、全基因组测序与安全性评价的一站式解决方案。

2. 样本来源与生物学背景

（1）样本来源与宿主分布的相关性：噬菌体丰度与其宿主菌的生态分布高度相关，样本来源的选择直接决定分离成功率。市政污水与医院污水是临床病原菌噬菌体的首选来源；养殖场废水、粪便与垫料适用于畜禽及水产病原菌；土壤与植物根际适合分离芽孢杆菌、假单胞菌及植物病原菌噬菌体；近海与淡水样本富含弧菌、气单胞菌噬菌体；食品加工环境样本则适合腐败菌与食源性致病菌噬菌体的挖掘。

（2）宿主特异性屏障：受体菌表面受体（LPS、荚膜多糖、磷壁酸、菌毛、鞭毛等）的结构差异、限制修饰系统（R-M）与 CRISPR-Cas 免疫系统的存在，使得同一菌种不同菌株之间的噬菌体敏感性可能完全不同，因此必须以客户实际使用的菌株（或菌株组合）作为指示菌开展筛选。

（3）裂解性与溶源性的甄别：用于治疗、食品防腐及生物防控的噬菌体必须为严格裂解性（烈性）噬菌体。温和噬菌体可携带整合酶、阻遏蛋白及毒力/耐药基因，存在溶原转换与横向基因转移风险，须在分离阶段即予以排除。

（4）环境基质的干扰：样本的 pH、离子强度（尤其 Ca²⁺/Mg²⁺ 浓度）、有机质负荷、悬浮颗粒与抗菌残留物均会显著影响噬菌体吸附效率与富集效果，需针对不同基质类型优化前处理与富集条件。

图1 环境样本噬菌体分离与典型噬菌斑形态

3. 主流分离与鉴定策略

3.1 富集培养法（Enrichment，主流方案）：

（1）原理：样本经离心与 0.22 μm 膜过滤去除菌体后，与对数生长期的目标宿主菌共培养，补加浓缩营养培养基，使环境中低丰度的特异性噬菌体获得选择性扩增，经多轮富集后显著提高检出率。

（2）优势：灵敏度高，适用于噬菌体丰度极低或宿主菌属于稀有类群的情形，是目前最常用的分离路线。

3.2 直接铺板法（Direct Plating）：

采用 Adams 经典双层琼脂平板法，将样本滤液与指示菌直接混合铺板。该方法保留了原始群落的多样性，可避免富集过程中"优势噬菌体"对稀有噬菌体的竞争性抑制，适用于需要构建多样性噬菌体库的项目。

3.3 单噬斑连续纯化：

自平板上挑取形态均一的单一噬斑，经连续三轮及以上的纯化传代，确保获得遗传背景纯净的单一噬菌体株，避免混合株带来的后续表征偏差。

3.4 宿主谱与效价评价：

先以点滴法（Spot Test）对菌株组进行快速初筛，再以成斑效率（EOP, Efficiency of Plating）定量确认真实增殖能力，可有效排除由高浓度噬菌体裂解酶造成的"由外裂解（lysis from without）"假阳性。

3.5 形态学与基因组鉴定：

透射电镜（TEM）负染观察噬菌体形态与结构参数；全基因组测序结合生物信息学注释，系统排查整合酶、溶原化模块、毒力因子（VFDB）与耐药基因（CARD/ResFinder）。

4. 核心应用领域

（1）噬菌体治疗与个性化用药：针对临床泛耐药菌分离株定向筛选高效裂解性噬菌体，支持同情用药、个性化鸡尾酒配伍及噬菌体药物管线的早期资源储备。

（2）食品安全与生物防腐：分离针对沙门氏菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌 O157:H7 等食源性致病菌的噬菌体，用于加工环境消杀与生物防腐制剂开发。

（3）农业与水产养殖生物防控：获得针对水产弧菌、气单胞菌、畜禽致病性大肠杆菌及植物病原菌（如青枯菌、软腐菌）的噬菌体，作为抗生素减量替代方案。

（4）工业发酵噬菌体污染溯源与防控：从污染的发酵罐、车间环境中分离噬菌体，明确污染源与噬菌体类型，为抗噬菌体菌株选育与工艺消杀方案提供依据。

（5）噬菌体资源库与元件挖掘：为科研机构与企业建设菌株配套的噬菌体资源库，并从中挖掘裂解酶、解聚酶、受体结合蛋白等高价值功能元件。

（6）检测与诊断开发：以分离获得的高特异性噬菌体为骨架，开发报告噬菌体、噬菌体生物传感器等快速检测工具。

5. 项目流程与验证

我们提供从方案设计到菌/毒株交付的一站式服务，确保每一株交付噬菌体来源清晰、性状明确、数据完整：

（1）方案设计与宿主菌确认：明确目标菌株、应用场景与验收指标；客户可提供自有菌株，亦可从我们的菌种现货平台中选择宿主菌。

（2）样本采集与预处理：依据目标菌的生态位设计采样方案，完成多点位样本采集、离心、过滤与保存。

（3）富集与初筛：多轮富集后以双层平板法与点滴法进行阳性判读，记录噬菌斑形态与初始效价。

（4）单斑纯化与扩增：连续三轮单斑纯化后进行液体扩增，获得高效价噬菌体原液。

（5）生物学特性表征：测定宿主谱、一步生长曲线（潜伏期与裂解量）、最佳感染复数（MOI）、温度与 pH 稳定性、紫外与消毒剂耐受性。

（6）纯化与质控：采用 PEG 沉淀、氯化铯密度梯度离心进行纯化，并提供内毒素去除与定量检测，满足动物实验及治疗级应用需求。

（7）鉴定与保藏：完成 TEM 形态学鉴定、全基因组测序与安全性生信分析，并提供甘油保藏服务。

6. 噬菌体分离服务项目介绍

6.1 核心服务包括：

（1）定制化噬菌体分离：以客户指定菌株为靶标，从客户来源环境样本中分离裂解性噬菌体。

（2）高效价扩增与纯化：提供从实验室级到治疗级的多档纯化方案，含内毒素去除与检测报告。

（3）生物学特性表征：宿主谱、一步生长曲线、稳定性等表征数据。

（4）全基因组测序与安全性分析：完整基因组组装与注释，重点排查溶原化模块、毒力基因与耐药基因，出具安全性评价意见。

（5）鸡尾酒配伍设计：基于宿主谱互补性、受体差异与抗性演化规律，设计覆盖面更广、抗性发生率更低的噬菌体组合。

（6）噬菌体保藏：提供长期保藏服务与稳定性数据。

6.2 技术优势：

（1）宿主菌资源配套：自有菌种现货平台与标准菌株库，客户无宿主菌时亦可快速启动项目。

（2）多来源样本网络：可利用市政与医院污水、养殖废水、土壤、水体及食品加工环境等多类样本来源，显著提高分离成功率。

（3）严格的烈性噬菌体判定标准：表型（不形成溶原、无浑浊噬斑）与基因组（无整合酶/阻遏子/毒力耐药基因）双重确认，从源头规避生物安全风险。

（4）平台联动：分离所得噬菌体可无缝衔接我们的噬菌体基因编辑、细菌前噬菌体预测及遗传修饰微生物安全性评估平台，形成"分离—改造—评价"完整链条。

（5）完整交付：提供噬菌体原液、保藏管与完整的实验数据报告。

7. 文献解读

案例：基于点滴法与划线纯化的环境样本噬菌体高效分离策略（Abebe AA, Birhanu AG, Tessema TS. (2025).  PLOS ONE, 20(9), e0331955.）

项目内容：从医院污水、废水与土壤等环境样本中，以多重耐药肺炎克雷伯菌为指示菌定向分离裂解性噬菌体，并通过"点滴法筛选 + 划线法纯化"的组合流程，在大幅降低耗材与时间成本的前提下获得比传统噬菌斑法更高的分离产出。

（1）研究背景

多重耐药肺炎克雷伯菌是世界卫生组织列为重点关注的耐药病原菌之一，噬菌体治疗是重要的替代方案。但噬菌体分离是所有下游工作的前置环节，传统噬菌斑法需要经历挑斑、缓冲液重悬、次日纯化裂解液、梯度稀释、逐个稀释度铺板等多个步骤，分离纯化单一株噬菌体往往需要 4–5 天甚至一周以上，且资源消耗随样本量呈指数增长。这一瓶颈在需要针对多株临床菌株快速组建鸡尾酒、或在资源受限条件下开展大规模筛选时尤为突出。本研究旨在建立一套更高效的环境噬菌体分离与纯化流程，并与传统方法进行平行比较。

（2）方案设计

研究于 2024 年 2 月至 11 月在亚的斯亚贝巴开展，从 20 个采样点采集了 62 份环境样本，采样点依据有机废弃物负荷高、噬菌体富集可能性大的原则选取，涵盖医院污水、废水与土壤三类基质。污水样本同时采集表层离散样与深层（25 cm 与 45 cm）混合样，经 SM 缓冲液匀浆、双倍浓度 LB 培养基 37 ℃ 180 rpm 振荡孵育 18 小时后，依次经 6000 rpm 离心、10000 rpm 二次离心与 0.22 μm 膜过滤制备滤液。

分离环节以两株多重耐药肺炎克雷伯菌（TA-SP18、TA-SP92）为指示菌，将平板划分为象限，每份样本上清取 20 μL 点样于菌苔上，18 小时后判读裂解圈；随后用接种环蘸取裂解圈中心，在新鲜底层琼脂上"之"字形划线，再从划线末端向起点缓慢倾注含宿主菌的软琼脂，以避免高浓度区噬菌体被冲刷，连续三轮纯化后获得单一噬菌体株。同批样本平行采用传统噬菌斑法作为对照。菌株鉴定采用 MALDI-TOF 质谱，耐药表型依据 CLSI 标准判定。表征内容包括效价、宿主谱（45 株受试菌）、成斑效率 EOP、最佳感染复数 MOI、一步生长曲线以及 pH 与温度稳定性。

（3）实验结论

从 62 份样本中共分离获得 39 株噬菌体，其中点滴法获得 22 株、噬菌斑法获得 17 株；更关键的是资源消耗差异——点滴法仅用 8 块平板即完成 62 份样本对两株宿主的筛选，而噬菌斑法需要 124 块平板，耗材相差约 16 倍。所得噬菌体效价跨度从 1.6 × 10⁴ 至 1.8 × 10¹¹ PFU/mL，研究者从中挑选 8 株高效价、噬斑清亮的噬菌体进入深度表征。

宿主谱分析显示，最广谱的噬菌体可裂解 45 株受试菌中的 25 株（55.5%），最窄者仅裂解 8 株（17.7%）。所有噬菌体对大肠杆菌 ATCC 25922、铜绿假单胞菌 ATCC 27853、鲍曼不动杆菌、奇异变形杆菌及全部臭鼻克雷伯菌均无裂解活性，体现出良好的属内特异性。一步生长曲线测得潜伏期 15–40 分钟、裂解量 76–310 PFU/细胞；最佳 MOI 分布于 0.1–10 之间；稳定性方面，所有噬菌体在 pH 5–9 区间保持有效裂解活性并在 pH 7 达到峰值，在 25–60 ℃ 范围内均维持活性，升至 70 ℃ 后仅 3 株存活且效价下降约 90%。

图2  环境样本噬菌体分离与宿主侵染

（4）应用意义

该研究为"按需、批量、低成本"的环境噬菌体分离提供了可直接落地的流程范式：以点滴法承担高通量初筛、以划线法替代繁琐的梯度稀释纯化，既保留了噬菌斑法的分辨率，又把单株噬菌体的获取周期与耗材消耗压缩到原来的很小一部分。对于需要同时针对多株临床分离株或生产菌株快速建库、组建鸡尾酒的项目，这一策略的效率优势尤为显著。

同时，该研究也明确指出了自身的局限——未开展分子与基因组层面的表征，因而无法确认所得噬菌体是否为严格裂解性、是否携带不良基因，作者建议后续必须补充基因组鉴定并开展体内效力评价。这恰好印证了我们服务体系的设计逻辑：分离只是起点，只有叠加全基因组测序与溶原化模块、毒力基因、耐药基因的系统排查，所得噬菌体才真正具备治疗、食品或生物防控应用的准入资格。

8. 参考文献

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